Ich bekam eine Zuschhrift die es in sich hat. Den Namen nenne ich nicht, ist auch nicht nötig, da ich diese Zuschrift mit Verlinkungen und Referenzen hier jetzt einsetze. Jeder kann sich diese Studie jetzt selbst ansehen und sich selbst ein Bild machen. Die Worte in dieser Zuschrift waren: Sorry Unser Kosmos , ich muss mal dringend vom Thema ablenken... geht ja eh nur um Propaganda um die Menschen in ihrer Psychose festzuhalten. Machst du vielleicht auch bald ein eigenes Posting draus, das muss alsbald viral gehen, denn von solchen Studien hört und sieht man nichts...
Das Spikeprotein, also das Antigen, das den eigentlichen Impfstoff darstellt und von den Körperzellen erst durch den Befehl der mRNA produziert wird, ist nicht nur nachgewiesen toxisch, schädigt nicht nur das Immunsystem (auch diese andere Studie), sondern jetzt kommt es knüppeldick und wundert keinen Verschwörungstheoretiker mehr...
Impfungen: Spike-Proteine im Zellkern und DNA-Schädigung nachgewiesen:
https://www.mdpi.com/1999-4915/13/10/2056/htm
Einfach nur anschauen.
Das ist eine brutale Erkentnis, das ist wirklich sehr brutal.
Hier die komplette Übersetzung: Offener Zugang Artikel
SARS-CoV-2-Spike beeinträchtigt die DNA-Schadensreparatur und hemmt die V(D)J-Rekombination in vitro
von Hui Jiang 1,2,* undYa-Fang Mei 2,*
1
Abteilung für Molekulare Biowissenschaften, The Wenner-Gren Institute, Universität Stockholm, SE-10691 Stockholm, Schweden
2
Abteilung für klinische Mikrobiologie, Virologie, Universität Umeå, SE-90185 Umeå, Schweden
*
Autoren, an die die Korrespondenz gerichtet werden sollte.
Akademischer Herausgeber: Oliver Schildgen
Viren 2021, 13(10), 2056; https://doi.org/10.3390/v13102056
Eingereicht am: 20 August 2021 / Überarbeitet: 8 September 2021 / Akzeptiert: 8. Oktober 2021 / Veröffentlicht: 13. Oktober 2021
(Dieser Artikel gehört zur Sonderausgabe SARS-CoV-2 Host Cell Interactions)
Zusammenfassung
Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) hat zur Pandemie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) geführt und die öffentliche Gesundheit und die Weltwirtschaft schwer beeinträchtigt. Die adaptive Immunität spielt eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung der SARS-CoV-2-Infektion und beeinflusst direkt die klinischen Ergebnisse der Patienten. Klinische Studien haben gezeigt, dass Patienten mit schwerer COVID-19-Infektion eine verzögerte und schwache adaptive Immunreaktion zeigen. Der Mechanismus, durch den SARS-CoV-2 die adaptive Immunität behindert, ist jedoch nach wie vor unklar. Mit Hilfe einer In-vitro-Zelllinie berichten wir, dass das SARS-CoV-2-Spike-Protein die DNA-Schadensreparatur, die für eine wirksame V(D)J-Rekombination in der adaptiven Immunität erforderlich ist, erheblich hemmt. Mechanistisch gesehen haben wir herausgefunden, dass das Spike-Protein im Zellkern lokalisiert ist und die DNA-Schadensreparatur hemmt, indem es die Rekrutierung der wichtigen DNA-Reparaturproteine BRCA1 und 53BP1 an der Schadensstelle behindert. Unsere Ergebnisse zeigen einen potenziellen molekularen Mechanismus auf, durch den das Spike-Protein die adaptive Immunität behindern könnte, und unterstreichen die potenziellen Nebenwirkungen von Impfstoffen auf Spike-Basis in voller Länge.
Stichworte: SARS-CoV-2; Spike; DNA-Schadensreparatur; V(D)J-Rekombination; Impfstoff
1. Einleitung
Das Coronavirus 2 des Schweren Akuten Respiratorischen Syndroms (SARS-CoV-2) ist für die derzeitige Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) verantwortlich, die zu mehr als 2,3 Millionen Todesfällen geführt hat. SARS-CoV-2 ist ein umhülltes Single-Positive-Sense-RNA-Virus, das aus strukturellen und nicht-strukturellen Proteinen besteht [1]. Nach der Infektion kapern und dysregulieren diese viralen Proteine die zelluläre Maschinerie des Wirts, um sich zu replizieren, zu assemblieren und Nachkommen zu verbreiten [2]. Jüngste klinische Studien haben gezeigt, dass eine SARS-CoV-2-Infektion die Anzahl und Funktion der Lymphozyten außerordentlich beeinträchtigt [3,4,5,6]. Im Vergleich zu leichten und mittelschweren Überlebenden weisen Patienten mit schwerem COVID-19 eine signifikant geringere Anzahl an Gesamt-T-Zellen, Helfer-T-Zellen und Suppressor-T-Zellen auf [3,4]. Außerdem verzögert COVID-19 die IgG- und IgM-Spiegel nach Auftreten der Symptome [5,6]. Insgesamt deuten diese klinischen Beobachtungen darauf hin, dass SARS-CoV-2 das adaptive Immunsystem beeinträchtigt. Der Mechanismus, durch den SARS-CoV-2 die adaptive Immunität unterdrückt, bleibt jedoch unklar.
Das Immunsystem und das DNA-Reparatursystem sind zwei wichtige Überwachungssysteme des Wirts und die wichtigsten Systeme, auf die sich höhere Organismen bei der Verteidigung gegen verschiedene Bedrohungen und bei der Gewebehomöostase verlassen. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass diese beiden Systeme voneinander abhängig sind, insbesondere während der Entwicklung und Reifung von Lymphozyten [7]. Als einer der wichtigsten Reparaturwege für DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) spielt die NHEJ-Reparatur (Non-Homologous End Joining) eine entscheidende Rolle bei der Lymphozyten-spezifischen V(D)J-Rekombination, die durch die aktivierende Gen-Endonuklease (RAG) vermittelt wird und zu einem äußerst vielfältigen Repertoire an Antikörpern in B-Zellen und T-Zell-Rezeptoren (TCRs) in T-Zellen führt [8]. So führt beispielsweise der Funktionsverlust wichtiger DNA-Reparaturproteine wie ATM, DNA-PKcs, 53BP1 u. a. zu Defekten bei der NHEJ-Reparatur, die die Produktion funktioneller B- und T-Zellen hemmen und zu Immunschwäche führen [7,9,10,11]. Im Gegensatz dazu führt eine Virusinfektion in der Regel über verschiedene Mechanismen zu DNA-Schäden, z. B. durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Replikationsstress in der Wirtszelle [12, 13, 14]. Wenn DNA-Schäden nicht ordnungsgemäß repariert werden können, tragen sie zur Verstärkung der durch die Virusinfektion ausgelösten Pathologie bei. Daher wollten wir untersuchen, ob SARS-CoV-2-Proteine das DNA-Schadensreparatursystem unterwandern und dadurch die adaptive Immunität in vitro beeinträchtigen.
2. Materialien und Methoden
2.1. Antikörper und Reagenzien
DAPI (Kat. #MBD0015), Doxorubicin (Kat. #D1515), H2O2 (Kat. #H1009) und β-Tubulin-Antikörper (Kat. #T4026) wurden von Sigma-Aldrich erworben. Antikörper gegen His-Tag (Kat. #12698), H2A (Kat. #12349), H2A.X (Kat. #7631), γ-H2A.X (Kat. #2577), Ku80 (Kat. #2753) und Rad51 (Kat. #8875) wurden von Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) erworben. Die Antikörper 53BP1 (Kat. #NB100-304) und RNF168 (Kat. #H00165918-M01) wurden von Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) bezogen. Die Antikörper Lamin B (Kat. #sc-374015), ATM (Kat. #sc-135663), DNA-PK (Kat. #sc-5282) und BRCA1 (Kat. #sc-28383) wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) erworben. Der Antikörper XRCC4 (Kat. #PA5-82264) wurde von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) erworben.
2.2. Plasmide
pHPRT-DRGFP und pCBASceI wurden freundlicherweise von Maria Jasin zur Verfügung gestellt (Addgene Plasmide #26476 und #26477) [15]. pimEJ5GFP war ein Geschenk von Jeremy Stark (Addgene Plasmid #44026) [16]. Die NSP1-, NSP9-, NSP13-, NSP14-, NSP16-, Spike- und Nukleokapsidproteine wurden zunächst durch Codon-Optimierung synthetisiert und dann in einen Säugetier-Expressionsvektor pUC57 mit einem C-terminalen 6xHis-Tag kloniert. Für den V(D)J-Reportervektor wurde eine invertierte RSS-GFP-Komplementärsequenz mit 12 Spacern synthetisiert - eine RSS mit 23 Spacern. Anschließend wurde die Sequenz in den pBabe-IRES-mRFP-Vektor kloniert, um den pBabe-12RSS-GFPi-23RSS-IRES-mRFP-Reporter-Vektor zu erzeugen. 12-Spacer-RSS-Sequenz: 5′-CACAGTGCTACAGACTGGAACAAAAACC-3′. 23-Abstandshalter-RSS-Sequenz: 5′-CACAGTGGTAGTACTCCACTGTCTGGCTGTACAAAAACC-3′. Die RAG1- und RAG2-Expressionskonstrukte wurden uns großzügig von Martin Gellert zur Verfügung gestellt (Addgene Plasmid #13328 und #13329) [17].
2.3. Zellen und Zellkultur
HEK293T- und HEK293-Zellen, die von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen wurden, wurden unter 5 % CO2 bei 37 °C in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, hohe Glukose, GlutaMAX) (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) mit 10 % (v/v) fetalem Kälberserum (FCS, Gibco), 1 % (v/v) Penicillin (100 IU/mL) und Streptomycin (100 μg/mL) kultiviert. HEK293T-DR-GFP- und HEK293T-EJ5-GFP-Reporterzellen wurden wie zuvor beschrieben erzeugt und unter 5 % CO2 bei 37 °C in dem oben genannten Nährmedium kultiviert. 2.4. HR- und NHEJ-Reporter-Assays
Die HR- und NHEJ-Reparatur in HEK293T-Zellen wurde wie zuvor beschrieben mit stabilen DR-GFP- und EJ5-GFP-Zellen gemessen. Kurz gesagt: 0,5 × 106 stabile HEK293T-Reporterzellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und mit 2 μg I-SceI-Expressionsplasmid (pCBASceI) zusammen mit SARS-CoV-2-Proteinexpressionsplasmiden transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion und der Aspirin-Behandlung wurden die Zellen geerntet und mittels Durchflusszytometrie auf die GFP-Expression untersucht. Die Mittelwerte wurden aus drei unabhängigen Experimenten gewonnen.
2.5. Zellfraktionierung und Immunoblotting
Für den Zellfraktionstest wurde das Subcellular Protein Fractionation Kit (Thermo Fisher) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Proteinlysate wurden mit dem BCA-Reagenz (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) quantifiziert. Die Proteine wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgelöst, auf Nitrocellulosemembranen (Amersham protran, 0,45 μm NC) übertragen und mit spezifischen primären Antikörpern und HRP-konjugierten sekundären Antikörpern immunoblottiert. Die Proteinbanden wurden mit dem SuperSignal West Pico oder Femto Chemilumineszenz-Kit (Thermo Fisher Scientific) nachgewiesen.
2.6. Comet-Assay
Die Zellen wurden mit verschiedenen DNA-Schadensreagenzien behandelt und dann zu den angegebenen Zeitpunkten für die Analyse geerntet. Die Zellen (1 × 105 Zellen/mL in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS]) wurden bei 40 °C in 1% niedrigschmelzender Agarose im Verhältnis 1:3 vol/vol resuspendiert und auf einen CometSlide pipettiert. Die Objektträger wurden dann in vorgekühlten Lysepuffer (1,2 M NaCl, 100 mM EDTA, 0,1 % Natriumlaurylsarkosinat, 0,26 M NaOH pH > 13) getaucht und über Nacht (18-20 h) bei 4 °C im Dunkeln lysiert. Anschließend wurden die Objektträger vorsichtig entnommen und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) und im Dunkeln in Spülpuffer (0,03 M NaOH und 2 mM EDTA, pH > 12) getaucht. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Die Objektträger wurden in eine horizontale Elektrophoresekammer mit Spülpuffer überführt und 25 Minuten lang bei einer Spannung von 0,6 V/cm getrennt. Schließlich wurden die Objektträger mit destilliertem Wasser gewaschen, mit 10 μg/mL Propidiumiodid angefärbt und fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Zwanzig Felder mit etwa 100 Zellen in jeder Probe wurden mit der Fiji-Software ausgewertet und quantifiziert, um die Schwanzlänge (Schwanzmoment) zu bestimmen. 2.7. Immunofluoreszenz
Die Zellen wurden auf Glasdeckgläsern in einer 12-Well-Platte ausgesät und 24 Stunden lang mit dem angegebenen Plasmid transfiziert. Anschließend wurden die Zellen je nach Versuchsaufbau mit oder ohne DNA-Schadensreagenzien behandelt. Die Zellen wurden 20 Minuten lang bei RT in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS fixiert und anschließend 10 Minuten lang in 0,5% Triton X-100 permeabilisiert. Die Objektträger wurden mit 5 % normalem Ziegenserum (NGS) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit in 1 % NGS verdünnten Primärantikörpern inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit den angegebenen, mit Alexa Fluor 488 oder 555 (Invitrogen) markierten Sekundärantikörpern, verdünnt in 1 %igem NGS, bei RT 1 Stunde lang inkubiert und anschließend 15 Minuten lang bei RT mit DAPI gefärbt. Die Deckgläser wurden mit Dako Fluorescence Mounting Medium (Agilent) aufgezogen und mit einem konfokalen Mikroskop von Nikon (Eclipse C1 Plus) abgebildet. Alle Auswertungen wurden unter verblindeten Bedingungen durchgeführt.
2.8. Analyse der V(D)J-Rekombination
Kurz gesagt, das V(D)J-Reporterplasmid enthält invertiertes GFP und IRES, das kontinuierlich exprimiertes RFP antreibt. Kontinuierlich exprimiertes RFP ist die interne Transfektionskontrolle. Nachdem das Rekombinationsaktivierungsgen 1/2 (RAG1/2) in die Zellen kotransfiziert wurde, schneidet RAG1/2 die RSS und vermittelt die Induktion von DSBs. Wenn V(D)J-Rekombination auftritt, werden die invertierten GFPs in positiver Reihenfolge durch NHEJ-Reparatur ligiert. Dann wird die Zelle funktionelles GFP exprimieren. Die doppelt positiven GFP- und RFP-Zellen sind also das Ergebnis des V(D)J-Reporter-Tests [18]. 293T-Zellen mit 70 % Konfluenz wurden mit dem V(D)J-GFP-Reporter allein (Hintergrund) oder in Kombination mit RAG1- und RAG2-Expressionskonstrukten in einem Verhältnis von 1 µg V(D)J-GFP-Reporter: 0,5 µg RAG1: 0,5 µg RAG2 transfiziert. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt, und nach weiteren 48 Stunden wurden die Zellen geerntet und mittels Durchflusszytometrie auf GFP- und RFP-Expression untersucht.
2.9. Statistische Auswertung
Alle Experimente wurden mindestens dreimal mit unabhängig voneinander gesammelten oder vorbereiteten Proben wiederholt. Die Daten wurden mittels Student's t-Test oder ANOVA, gefolgt von Tukey's Multiple-Comparison-Tests mit GraphPad 8 analysiert. 3. Ergebnisse
3.1. Wirkung der im Zellkern lokalisierten SARS-CoV-2-Virusproteine auf die DNA-Schadensreparatur
Die Reparatur von DNA-Schäden erfolgt hauptsächlich im Zellkern, um die Stabilität des Genoms zu gewährleisten. Obwohl SARS-CoV-2-Proteine im Zytosol synthetisiert werden [1], sind einige virale Proteine auch im Zellkern nachweisbar, darunter Nsp1, Nsp5, Nsp9, Nsp13, Nsp14 und Nsp16 [19]. Wir untersuchten, ob diese im Kern lokalisierten SARS-CoV-2-Proteine das DNA-Schadensreparatursystem der Wirtszelle beeinflussen. Zu diesem Zweck konstruierten wir diese viralen Proteinexpressionsplasmide zusammen mit Spike- und Nukleoproteinexpressionsplasmiden, die im Allgemeinen als zytosollokalisierte Proteine gelten. Wir bestätigten ihre Expression und Lokalisierung durch Immunoblotting und Immunfluoreszenz (Abbildung 1A und Abbildung S1A). Unsere Ergebnisse stimmten mit denen früherer Studien überein [19]; die Proteine Nsp1, Nsp5, Nsp9, Nsp13, Nsp14 und Nsp16 sind tatsächlich im Zellkern lokalisiert, während die Nukleoproteine hauptsächlich im Zytosol zu finden sind. Überraschenderweise fanden wir die Häufigkeit des Spike-Proteins im Zellkern (Abbildung 1A). Die NHEJ-Reparatur und die Reparatur durch homologe Rekombination (HR) sind zwei wichtige DNA-Reparaturwege, die nicht nur die Integrität des Genoms kontinuierlich überwachen und sicherstellen, sondern auch für die Funktionen der adaptiven Immunzellen unerlässlich sind [9]. Um festzustellen, ob diese viralen Proteine den DSB-Reparaturweg behindern, untersuchten wir die Reparatur eines ortsspezifischen DSB, der durch die I-SceI-Endonuklease induziert wurde, unter Verwendung des direkten Repeat-Grünfluoreszenzproteins (DR-GFP) und des Gesamt-NHEJ-GFP (EJ5-GFP) Reportersystems für HR bzw. NHEJ [15,16]. Die Überexpression von Nsp1, Nsp5, Nsp13, Nsp14 und Spike-Proteinen verringerte die Effizienz sowohl der HR- als auch der NHEJ-Reparatur (Abbildung 1B-E und Abbildung S2A,B). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Überexpression von Nsp1, Nsp5, Nsp13 und Nsp14 die Proliferation im Vergleich zu anderen untersuchten Proteinen drastisch unterdrückte (Abbildung S3A,B). Die hemmende Wirkung von Nsp1, Nsp5, Nsp13 und Nsp14 auf die Reparatur von DNA-Schäden könnte daher auf sekundäre Effekte wie Wachstumsstillstand und Zelltod zurückzuführen sein. Interessanterweise wirkte sich das überexprimierte Spike-Protein nicht auf die Zellmorphologie oder -proliferation aus, unterdrückte aber sowohl die HR- als auch die NHEJ-Reparatur signifikant (Abbildung 1B-E, Abbildungen S2A,B und S3A,B).
Abbildung 1. Auswirkung der im Kern lokalisierten Proteine des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) auf die Reparatur von DNA-Schäden. (A) Subzelluläre Verteilung der SARS-CoV-2-Proteine. Die Immunfluoreszenz wurde 24 h nach Transfektion des Plasmids, das die viralen Proteine exprimiert, in HEK293T-Zellen durchgeführt. Maßstabsbalken: 10 µm. (B) Schematische Darstellung des EJ5-GFP-Reporters, der zur Überwachung der nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) verwendet wird. (C) Wirkung des leeren Vektors (E.V.) und der SARS-CoV-2-Proteine auf die NHEJ-DNA-Reparatur. Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus drei unabhängigen Experimenten dar (siehe repräsentative FACS-Plots in Abbildung S2A). (D) Schematische Darstellung des DR-GFP-Reporters, der zur Überwachung der homologen Rekombination (HR) verwendet wird. (E) Wirkung von E.V- und SARS-CoV-2-Proteinen auf die HR-DNA-Reparatur. Die Werte stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dar (siehe repräsentative FACS-Plots in Abbildung S2B). Die Werte stellen den Mittelwert ± SD dar, n = 3. Die statistische Signifikanz wurde mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) in (C,E) bestimmt. ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. 3.2. SARS-CoV-2-Spike-Protein hemmt DNA-Schadensreparatur
Da Spike-Proteine für die Vermittlung des viralen Eintritts in die Wirtszellen entscheidend sind und im Mittelpunkt der meisten Impfstrategien stehen [20,21], haben wir die Rolle der Spike-Proteine bei der DNA-Schadensreparatur und der damit verbundenen V(D)J-Rekombination weiter untersucht. Es wird angenommen, dass Spike-Proteine im rauen endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert werden [1]. Nach posttranslationalen Modifikationen wie der Glykosylierung werden Spike-Proteine zusammen mit anderen viralen Proteinen durch den zellulären Membranapparat transportiert und bilden das reife Virion [1]. Das Spike-Protein enthält zwei Hauptuntereinheiten, S1 und S2, sowie mehrere funktionelle Domänen oder Wiederholungen [22] (Abbildung 2A). Im nativen Zustand liegen die Spike-Proteine als inaktive Proteine in voller Länge vor. Während der viralen Infektion aktivieren Proteasen der Wirtszelle, wie z. B. die Furin-Protease, das S-Protein, indem sie es in die Untereinheiten S1 und S2 spalten, was für den Eintritt des Virus in die Zielzelle notwendig ist [23]. Wir untersuchten verschiedene Untereinheiten des Spike-Proteins, um die für die Hemmung der DNA-Reparatur erforderlichen funktionellen Merkmale zu klären. Nur das Spike-Protein in voller Länge hemmte sowohl die NHEJ- als auch die HR-Reparatur stark (Abbildung 2B-E und Abbildung S4A,B). Als Nächstes versuchten wir zu bestimmen, ob das Spike-Protein durch die Hemmung der DSB-Reparatur direkt zur genomischen Instabilität beiträgt. Wir überwachten die Anzahl der DSBs mit Hilfe von Comet-Assays. Nach verschiedenen DNA-Schadensbehandlungen, wie γ-Bestrahlung, Doxorubicin-Behandlung und H2O2-Behandlung, findet in Gegenwart des Spike-Proteins weniger Reparatur statt (Abbildung 2F und G). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das Spike-Protein die DNA-Reparatur im Zellkern direkt beeinflusst.
Abbildung 2. Das Spike-Protein des schweren akuten respiratorischen Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) hemmt die Reparatur von DNA-Schäden. (A) Schematische Darstellung der Primärstruktur des SARS-CoV-2-Spike-Proteins. Die S1-Untereinheit umfasst eine N-terminale Domäne (NTD, 14-305 Reste) und eine rezeptorbindende Domäne (RBD, 319-541 Reste). Die S2-Untereinheit besteht aus dem Fusionspeptid (FP, 788-806 Reste), der Heptapeptidwiederholungssequenz 1 (HR1, 912-984 Reste), HR2 (1163-1213 Reste), der TM-Domäne (TM, 1213-1237 Reste) und der Zytoplasmadomäne (CT, 1237-1273 Reste). (B,C) Wirkung der titrierten Expression des Spike-Proteins auf die DNA-Reparatur in HEK-293T-Zellen. (D,E) Nur das Spike-Protein in voller Länge hemmt die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) der DNA-Reparatur. Die Werte stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dar (siehe repräsentative FACS-Plots in Abbildung S4A,B). (F) Mit dem Spike-Protein in voller Länge (S-FL) transfizierte HEK293T-Zellen wiesen unter verschiedenen DNA-Schadensbedingungen mehr DNA-Schäden auf als leere Vektor-, S1- und S2-transfizierte Zellen. Für Doxorubicin: 4 µg/mL, 2 h. Für γ-Bestrahlung: 10 Gy, 30 min. Für H2O2: 100 µM, 1 h. Maßstabsbalken: 50 µm. (G) Entsprechende Quantifizierung der Kometenschweifmomente aus 20 verschiedenen Feldern mit n > 200 Kometen aus drei unabhängigen Experimenten. Die statistische Signifikanz wurde mit einer zweifachen Varianzanalyse (ANOVA) ermittelt. NS (nicht signifikant): * p > 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.
3.3. Spike-Proteine behindern die Rekrutierung von DNA-Schadensreparatur-Checkpoint-Proteinen
Um die Existenz des Spike-Proteins im Zellkern zu bestätigen, führten wir eine Analyse der subzellulären Fraktionen durch und stellten fest, dass Spike-Proteine nicht nur in der Zellmembranfraktion angereichert sind, sondern auch in der Kernfraktion reichlich vorhanden sind, mit nachweisbarer Expression sogar in der chromatingebundenen Fraktion (Abbildung 3A). Wir beobachteten auch, dass der Spike drei verschiedene Formen hat: die obere Bande ist ein hoch glykosylierter Spike, die mittlere ist ein Spike in voller Länge und die untere ist eine gespaltene Spike-Untereinheit. In Übereinstimmung mit dem Comet-Assay fanden wir auch die Hochregulierung des DNA-Schadensmarkers γ-H2A.X in Spike-Protein-überexprimierten Zellen unter DNA-Schadensbedingungen (Abbildung 3B). Eine kürzlich durchgeführte Studie legt nahe, dass Spike-Proteine ER-Stress und ER-assoziierten Proteinabbau induzieren [24]. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass das Spike-Protein die DNA-Reparatur hemmt, indem es den Abbau von DNA-Reparaturproteinen fördert, überprüften wir die Expression einiger wesentlicher DNA-Reparaturproteine in den NHEJ- und HR-Reparaturwegen und stellten fest, dass diese DNA-Reparaturproteine nach der Spike-Protein-Überexpression stabil waren (Abbildung 3C). Um festzustellen, wie das Spike-Protein sowohl NHEJ- als auch HR-Reparaturwege hemmt, analysierten wir die Rekrutierung von BRCA1 und 53BP1, die die wichtigsten Checkpoint-Proteine für HR- bzw. NHEJ-Reparatur sind. Wir stellten fest, dass das Spike-Protein sowohl die Bildung von BRCA1- als auch von 53BP1-Foci deutlich hemmte (Abbildung 3D-G). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das SARS-CoV-2 Spike-Protein in voller Länge die DNA-Schadensreparatur hemmt, indem es die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen behindert.
Abbildung 3. Das Spike-Protein des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) behindert die Rekrutierung von DNA-Schadensreparatur-Checkpoint-Proteinen. (A) Membranfraktion (MF), zytosolische Fraktion (CF), lösliche Kernfraktion (SNF) und Chromatin-gebundene Fraktion (CBF) von HEK293T-Zellen, die mit SARS-CoV-2-Spike-Protein transfiziert wurden, wurden immunoblottiert für His-Tag-Spike und die angegebenen Proteine. (B) Links: Immunoblots des DNA-Schadensmarkers γH2AX in leeren Vektor- (E.V.) und Spike-Protein-exprimierenden HEK293T-Zellen nach 10 Gy γ-Bestrahlung. Rechts: entsprechende Quantifizierung der Immunoblots links. Die Werte stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 3). Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student's t-Test ermittelt. **** p < 0.0001. (C) Immunoblots von Proteinen, die mit der DNA-Schadensreparatur zusammenhängen, in HEK293T-Zellen, die Spike-Protein exprimieren. (D) Repräsentative Bilder der 53BP1-Foci-Bildung in E.V- und Spike-Protein-exprimierenden HEK293-Zellen, die einer 10 Gy γ-Bestrahlung ausgesetzt wurden. Maßstabsleiste: 10 µm. (E) Quantitative Analyse der 53BP1-Foki pro Zellkern. Die Werte stellen den Mittelwert ± SEM dar, n = 50. (F) Bildung von BRCA1-Foci in leeren Vektor- und Spike-Protein-exprimierenden HEK293-Zellen, die einer 10 Gy γ-Bestrahlung ausgesetzt wurden. Skalenbalken: 10 µm. (G). Quantitative Analyse der BRCA1-Foki pro Zellkern. Die Werte stellen den Mittelwert ± SEM dar, n = 50. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student's t-Test ermittelt. **** p < 0.0001.
3.4. Das Spike-Protein beeinträchtigt die V(D)J-Rekombination in vitro
Die DNA-Schadensreparatur, insbesondere die NHEJ-Reparatur, ist wesentlich für die V(D)J-Rekombination, die das Herzstück der B- und T-Zell-Immunität darstellt [9]. Bislang wurden viele zugelassene SARS-CoV-2-Impfstoffe, wie mRNA-Impfstoffe und Adenovirus-COVID-19-Impfstoffe, auf der Grundlage des Spike-Proteins in voller Länge entwickelt [25]. Obwohl es umstritten ist, ob SARS-CoV-2 direkt Lymphozytenvorläufer infiziert [26,27], haben einige Berichte gezeigt, dass infizierte Zellen Exosome absondern, die SARS-CoV-2-RNA oder -Protein an Zielzellen abgeben können [28,29]. Wir haben weiter getestet, ob das Spike-Protein die NHEJ-vermittelte V(D)J-Rekombination reduziert. Zu diesem Zweck haben wir ein in vitro V(D)J-Rekombinationsreportersystem gemäß einer früheren Studie [18] entwickelt (Abbildung S5). Im Vergleich zum leeren Vektor hemmte die Überexpression des Spike-Proteins die RAG-vermittelte V(D)J-Rekombination in diesem in vitro Reportersystem (Abbildung 4).
Abbildung 4. Das Spike-Protein beeinträchtigt die V(D)J-Rekombination in vitro. (A) Schematische Darstellung des V(D)J-Reportersystems. (B) Repräsentative Diagramme der Durchflusszytometrie zeigen, dass das SARS-CoV-2-Spike-Protein die V(D)J-Rekombination in vitro beeinträchtigt. (C) Quantitative Analyse der relativen V(D)J-Rekombination. Die Werte stellen den Mittelwert ± SD dar, n = 3. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student's t-test ermittelt. **** p < 0.0001.
4. Diskussion
Unsere Ergebnisse belegen, dass das Spike-Protein die DNA-Schadensreparaturmaschinerie und die adaptive Immunmaschinerie in vitro unterwandert. Wir schlagen einen möglichen Mechanismus vor, durch den Spike-Proteine die adaptive Immunität durch Hemmung der DNA-Schadensreparatur beeinträchtigen können. Obwohl keine Beweise dafür veröffentlicht wurden, dass SARS-CoV-2 Thymozyten oder lymphoide Zellen des Knochenmarks infizieren kann, zeigt unser in vitro V(D)J-Reporter-Assay, dass das Spike-Protein die V(D)J-Rekombination stark behindert. Im Einklang mit unseren Ergebnissen zeigen auch klinische Beobachtungen, dass das Risiko einer schweren Erkrankung oder eines Todes durch COVID-19 mit dem Alter zunimmt, insbesondere bei älteren Erwachsenen, die das höchste Risiko tragen [22]. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass SARS-CoV-2-Spike-Proteine das DNA-Reparatursystem älterer Menschen schwächen und folglich die V(D)J-Rekombination und die adaptive Immunität behindern können. Im Gegensatz dazu liefern unsere Daten wertvolle Details über die Beteiligung von Spike-Protein-Untereinheiten an der DNA-Schadensreparatur, was darauf hindeutet, dass Impfstoffe auf Spike-Basis in voller Länge die Rekombination von V(D)J in B-Zellen hemmen können, was auch mit einer kürzlich durchgeführten Studie übereinstimmt, in der ein Impfstoff auf Spike-Basis in voller Länge niedrigere Antikörpertiter im Vergleich zu einem Impfstoff auf RBD-Basis induzierte [28]. Dies deutet darauf hin, dass die Verwendung antigener Epitope des Spikes als SARS-CoV-2-Impfstoff sicherer und wirksamer sein könnte als der Spike in voller Länge. Insgesamt haben wir einen der potenziell wichtigen Mechanismen der Unterdrückung des adaptiven Immunsystems des Wirts durch SARS-CoV-2 identifiziert. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse auch auf eine mögliche Nebenwirkung des Impfstoffs auf Basis von Spikes in voller Länge hin. Diese Arbeit wird das Verständnis der Pathogenese von COVID-19 verbessern und neue Strategien für die Entwicklung effizienterer und sichererer Impfstoffe liefern. Ergänzende Materialien
Abbildung S1: Expression von kernständig lokalisierten SARS-CoV-2-Proteinen in menschlichen Zellen, Abbildung S2: Wirkung von kernständigen SARS-CoV-2-Proteinen auf den NHEJ- und HR-DNA-Reparaturpfad, Abbildung S3: Nsp1, Nsp5, Nsp13, Nsp14, aber nicht Spike hemmen die Zellproliferation, Abbildung S4: Wirkung von SARS-CoV-2-Spike-Mutanten auf den NHEJ- und HR-DNA-Reparaturweg, Abbildung S5: In vitro V(D)J-Rekombinationstest.
Beiträge der Autoren
H.J. konzipierte und gestaltete die Studie. H.J. und Y.-F.M. leiteten die Studie, führten die Experimente durch und interpretierten die Daten. Schreiben - Erstellung des ursprünglichen Entwurfs, H.J.; Schreiben - Überprüfung und Bearbeitung, H.J. und Y.-F.M.; Beschaffung von Finanzmitteln, Y.-F.M. Alle Autoren haben die veröffentlichte Fassung des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.
Finanzierung
Diese Arbeit wurde durch die Planungszuschüsse der Medizinischen Fakultät der Universität Umeå für COVID-19 (Forschungsprojektnummer: 3453 16032 für Y.F.M.), die Lion's Cancer Research Foundation an der Universität Umeå (Zuschüsse: LP 17-2153, AMP 19-982 und LP 20-2256 für Y.F.M.) und die ALF-Mittel der Basiseinheit für die Forschung an akademischen Gesundheitseinrichtungen und universitären Gesundheitseinrichtungen in der nördlichen Gesundheitsregion (ALF-Basenheten: 2019, 2020, 2021 für Y.F.M.) unterstützt.
Stellungnahme des Institutional Review Board
Nicht zutreffend, da diese Studie weder Menschen noch Tiere umfasst.
Erklärung zur Einwilligung nach Aufklärung
Nicht zutreffend, da diese Studie nicht am Menschen durchgeführt wird.
Erklärung zur Datenverfügbarkeit
Die in dieser Studie präsentierten Daten sind im Haupttext und in den ergänzenden Materialien verfügbar.
Interessenkonflikte
Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts. Referenzen:
V’Kovski, P.; Kratzel, A.; Steiner, S.; Stalder, H.; Thiel, V. Coronavirus biology and replication: Implications for SARS-CoV-2. Nat. Rev. Microbiol. 2021, 19, 155–170. [Google Scholar] [CrossRef]
Suryawanshi, R.K.; Koganti, R.; Agelidis, A.; Patil, C.D.; Shukla, D. Dysregulation of Cell Signaling by SARS-CoV-2. Trends Microbiol. 2021, 29, 224–237. [Google Scholar] [CrossRef]
Qin, C.; Zhou, L.; Hu, Z.; Zhang, S.; Yang, S.; Tao, Y.; Xie, C.; Ma, K.; Shang, K.; Wang, W.; et al. Dysregulation of Immune Response in Patients With Coronavirus 2019 (COVID-19) in Wuhan, China. Clin. Infect. Dis. 2020, 71, 762–768. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Wang, F.; Nie, J.; Wang, H.; Zhao, Q.; Xiong, Y.; Deng, L.; Song, S.; Ma, Z.; Mo, P.; Zhang, Y. Characteristics of Peripheral Lymphocyte Subset Alteration in COVID-19 Pneumonia. J. Infect. Dis. 2020, 221, 1762–1769. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Zhang, G.; Nie, S.; Zhang, Z.; Zhang, Z. Longitudinal Change of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Antibodies in Patients with Coronavirus Disease 2019. J. Infect. Dis. 2020, 222, 183–188. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Long, Q.X.; Liu, B.Z.; Deng, H.J.; Wu, G.C.; Deng, K.; Chen, Y.K.; Liao, P.; Qiu, J.F.; Lin, Y.; Cai, X.F.; et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nat. Med. 2020, 26, 845–848. [Google Scholar] [CrossRef]
Bednarski, J.J.; Sleckman, B.P. Lymphocyte development: Integration of DNA damage response signaling. Adv. Immunol. 2012, 116, 175–204. [Google Scholar] [PubMed]
Malu, S.; Malshetty, V.; Francis, D.; Cortes, P. Role of non-homologous end joining in V(D)J recombination. Immunol. Res. 2012, 54, 233–246. [Google Scholar] [CrossRef]
Bednarski, J.J.; Sleckman, B.P. At the intersection of DNA damage and immune responses. Nat. Rev. Immunol. 2019, 19, 231–242. [Google Scholar] [CrossRef]
Gapud, E.J.; Sleckman, B.P. Unique and redundant functions of ATM and DNA-PKcs during V(D)J recombination. Cell. Cycle 2011, 10, 1928–1935. [Google Scholar] [CrossRef]
Difilippantonio, S.; Gapud, E.; Wong, N.; Huang, C.Y.; Mahowald, G.; Chen, H.T.; Kruhlak, M.J.; Callen, E.; Livak, F.; Nussenzweig, M.C.; et al. 53BP1 facilitates long-range DNA end-joining during V(D)J recombination. Nature 2008, 456, 529–533. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Schwarz, K.B. Oxidative stress during viral infection: A review. Free Radic. Biol. Med. 1996, 21, 641–649. [Google Scholar] [CrossRef]
Xu, L.H.; Huang, M.; Fang, S.G.; Liu, D.X. Coronavirus infection induces DNA replication stress partly through interaction of its nonstructural protein 13 with the p125 subunit of DNA polymerase delta. J. Biol. Chem. 2011, 286, 39546–39559. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Delgado-Roche, L.; Mesta, F. Oxidative Stress as Key Player in Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV) Infection. Arch. Med. Res. 2020, 51, 384–387. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Pierce, A.J.; Hu, P.; Han, M.; Ellis, N.; Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 2001, 15, 3237–3242. [Google Scholar] [CrossRef]
Bennardo, N.; Cheng, A.; Huang, N.; Stark, J.M. Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 2008, 4, e1000110. [Google Scholar] [CrossRef]
Sadofsky, M.J.; Hesse, J.E.; McBlane, J.F.; Gellert, M. Expression and V(D)J recombination activity of mutated RAG-1 proteins. Nucleic Acids Res. 1993, 21, 5644–5650. [Google Scholar] [CrossRef]
Trancoso, I.; Bonnet, M.; Gardner, R.; Carneiro, J.; Barreto, V.; Demengeot, J.; Sarmento, L. A Novel Quantitative Fluorescent Reporter Assay for RAG Targets and RAG Activity. Front. Immunol. 2013, 4, 110. [Google Scholar] [CrossRef]
Zhang, J.; Cruz-cosme, R.; Zhuang, M.-W.; Liu, D.; Liu, Y.; Teng, S.; Wang, P.-H.; Tang, Q. A systemic and molecular study of subcellular localization of SARS-CoV-2 proteins. Signal Transduct. Target. Ther. 2020, 5, 269. [Google Scholar] [CrossRef]
Shang, J.; Wan, Y.; Luo, C.; Ye, G.; Geng, Q.; Auerbach, A.; Li, F. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2020, 117, 11727–11734. [Google Scholar] [CrossRef]
Du, L.; He, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, B.J.; Jiang, S. The spike protein of SARS-CoV—A target for vaccine and therapeutic development. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 226–236. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Huang, Y.; Yang, C.; Xu, X.F.; Xu, W.; Liu, S.W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: Potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacol. Sin. 2020, 41, 1141–1149. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
Hoffmann, M.; Kleine-Weber, H.; Schroeder, S.; Kruger, N.; Herrler, T.; Erichsen, S.; Schiergens, T.S.; Herrler, G.; Wu, N.H.; Nitsche, A.; et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell 2020, 181, 271–280.e8. [Google Scholar] [CrossRef]
Hsu, A.C.-Y.; Wang, G.; Reid, A.T.; Veerati, P.C.; Pathinayake, P.S.; Daly, K.; Mayall, J.R.; Hansbro, P.M.; Horvat, J.C.; Wang, F.; et al. SARS-CoV-2 Spike protein promotes hyper-inflammatory response that can be ameliorated by Spike-antagonistic peptide and FDA-approved ER stress and MAP kinase inhibitors in vitro. bioRxiv 2020, 2020, 317818. [Google Scholar]
Poland, G.A.; Ovsyannikova, I.G.; Kennedy, R.B. SARS-CoV-2 immunity: Review and applications to phase 3 vaccine candidates. Lancet 2020, 396, 1595–1606. [Google Scholar] [CrossRef]
Davanzo, G.G.; Codo, A.C.; Brunetti, N.S.; Boldrini, V.; Knittel, T.L.; Monterio, L.B.; de Moraes, D.; Ferrari, A.J.R.; de Souza, G.F.; Muraro, S.P.; et al. SARS-CoV-2 Uses CD4 to Infect T Helper Lymphocytes. medRxiv 2020, 2020, 20200329. [Google Scholar]
Borsa, M.; Mazet, J.M. Attacking the defence: SARS-CoV-2 can infect immune cells. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 592. [Google Scholar] [CrossRef]
Barberis, E.; Vanella, V.V.; Falasca, M.; Caneapero, V.; Cappellano, G.; Raineri, D.; Ghirimoldi, M.; De Giorgis, V.; Puricelli, C.; Vaschetto, R.; et al. Circulating Exosomes Are Strongly Involved in SARS-CoV-2 Infection. Front. Mol. Biosci. 2021, 8, 632290. [Google Scholar] [CrossRef]
Sur, S.; Khatun, M.; Steele, R.; Isbell, T.S.; Ray, R.; Ray, R.B. Exosomes from COVID-19 patients carry tenascin-C and fibrinogen-β in triggering inflammatory signals in distant organ cells. bioRxiv 2021, 2021, 430369. [Google Scholar]
Publisher’s Note: MDPI stays neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
das haut einem die sicherung raus! mich betriffts nicht - hab auf meine innere stimme gehört!